Lab-on-chip thường tách tế bào bằng kích thước: Chip mới để CAR T “bộc lộ” sức mạnh qua cách chúng biến dạng

Một tế bào có thể mang đúng marker mà nhà nghiên cứu muốn thấy nhưng vẫn không hoạt động giống một tế bào khác có cùng marker. Với CAR T, khác biệt đó đặc biệt quan trọng: hai lô tế bào có thể trông khá giống nhau trên flow cytometry nhưng khác về mức hoạt hóa, trạng thái nhớ, khả năng biến dạng và cuối cùng là năng lực tiêu diệt tế bào ung thư.

Một nhóm tại Singapore-MIT Alliance for Research and Technology (SMART), MIT và các đối tác lâm sàng ở Singapore đang thử đọc phần thông tin khó thấy này bằng cơ học. Họ tạo một assay vi lưu có tên Cell Trajectory Modulation, hay CTM, trong đó CAR T được đẩy qua các dãy micropillar ở nhiều điều kiện dòng chảy. Thay vì hỏi tế bào “có marker X hay không”, hệ thống quan sát một câu hỏi khác: khi bị buộc phải đi qua chướng ngại vật, tế bào đi theo quỹ đạo nào và biến dạng ra sao?

Trong nghiên cứu đăng trên Nature Communications, những dấu vân tay biophysical này có tương quan với nhiều đặc điểm thường phải đo bằng flow cytometry, đồng thời tương quan với khả năng CAR T giết tế bào leukemia CD19+ trong assay chức năng. Hệ chỉ cần khoảng 20 µL mẫu, dưới 10.000 tế bào và hoàn thành profile trong chưa tới 10 phút.

Đó chưa phải một chip có thể nhìn một tế bào rồi tuyên bố nó “khỏe” hay “yếu”. Nhưng nghiên cứu gợi ý một hướng khác cho lab-on-chip: thay vì chỉ tách tế bào theo kích thước hoặc gắn nhãn để đọc protein bề mặt, có thể dùng chính phản ứng cơ học của tế bào như một phần của phép đo chất lượng.

Tách theo kích thước là hữu ích, nhưng tế bào không phải những hạt nhựa cứng

Một trong những kỹ thuật nền tảng của microfluidics là deterministic lateral displacement (DLD). Chip DLD chứa những dãy cột siêu nhỏ được bố trí lệch nhau theo quy luật. Hạt hoặc tế bào nhỏ hơn một kích thước tới hạn thường đi gần theo hướng dòng chảy; vật thể lớn hơn bị va chạm lặp lại với các cột và bị dịch dần sang một hướng khác.

Nguyên lý này rất hiệu quả khi vật thể có hình học và độ cứng tương đối ổn định. Tế bào sống thì phức tạp hơn. Cùng một loại T cell có thể thay đổi kích thước khi được kích hoạt, mềm hoặc cứng hơn khi trạng thái sinh học thay đổi, và biến dạng khác nhau dưới shear stress.

Trong nhiều hệ thống DLD, những thay đổi đó là một nguồn nhiễu: tế bào có cùng kích thước danh nghĩa nhưng không đi đúng quỹ đạo dự đoán vì chúng mềm khác nhau. Nhóm SMART/MIT đảo ngược cách nhìn. Thay vì cố loại bỏ sai lệch này, họ biến nó thành tín hiệu đo.

Một “obstacle course” với bốn bài kiểm tra khác nhau

CTM sử dụng hai kiểu cấu trúc micropillar, dạng L và L đảo ngược, kết hợp với hai mức tốc độ dòng chảy. Ở điều kiện dòng chảy thấp, tế bào ít biến dạng hơn nên vị trí đầu ra phản ánh mạnh yếu tố kích thước. Khi tốc độ được tăng khoảng 10 lần, lực thủy động lớn hơn ép tế bào biến dạng rõ hơn, khiến quỹ đạo mang thêm thông tin về tính cơ học.

Kết quả là bốn histogram H1–H4. H1 và H2 chủ yếu mô tả profile kích thước; H3 và H4 nhạy hơn với deformability. Phần mềm sau đó biến các histogram này thành 88 đặc trưng CTM thuộc ba nhóm: size, deformation và các đặc trưng kết hợp cả hai.

Nói “tế bào tự chứng minh nó khỏe đến đâu” vì vậy chỉ là một cách hình dung. Tế bào không chủ động chọn đường như một sinh vật vượt mê cung. Chúng bị dòng chất lỏng ép tương tác với cấu trúc chip, và chính phản ứng vật lý trong quá trình đó trở thành phép đo.

Điều đáng chú ý là setup không cần kính hiển vi độ phóng đại rất cao hay high-speed camera đắt tiền như một số kỹ thuật deformability cytometry khác. Paper cho biết CTM dùng objective 4× cùng camera machine-vision tiêu chuẩn, trong khi tế bào vẫn ở môi trường nuôi cấy gốc.

Khi CAR T được kích hoạt, dấu vân tay cơ học cũng thay đổi

Nhóm đầu tiên kiểm tra xem CTM có phân biệt được những trạng thái T cell đã biết hay không. Tế bào chưa kích hoạt, tế bào được kích hoạt bằng CD3/CD28 và tế bào tiếp xúc với DMSO cho các profile khác nhau.

Điều này phù hợp với sinh học của T cell. Khi kích hoạt, tế bào có thể tăng kích thước và tái cấu trúc cytoskeleton; các quá trình đông lạnh và rã đông dùng DMSO cũng có thể thay đổi tính chất cơ học của màng. CTM không trực tiếp đo những pathway phân tử đó, nhưng nó nhìn thấy hệ quả vật lý của chúng.

Nhóm sau đó nuôi anti-CD19 CAR T từ cùng nguồn donor bằng hai nền tảng khác nhau: G-Rex, một hệ culture phổ biến trong sản xuất CAR T, và Breez, một microbioreactor perfusion. Sau 12 ngày, 21 trong số 88 đặc trưng CTM khác biệt có ý nghĩa giữa hai nhóm, dù nguồn tế bào, cách transduction và activation được giữ tương tự.

Flow cytometry cũng phát hiện khác biệt phenotype giữa hai quy trình. Một số CTM feature có tương quan mạnh với các chỉ số quen thuộc như tỷ lệ CD4:CD8, CD127 và CAR expression. Điều này cho thấy cơ học tế bào không phải một lớp dữ liệu hoàn toàn tách biệt với sinh học phân tử; nó phản ánh một phần những thay đổi xảy ra bên trong tế bào khi trạng thái chức năng thay đổi.

Phần hấp dẫn nhất: quỹ đạo cơ học tương quan với khả năng giết tế bào ung thư

Để không chỉ dừng ở morphology, nhóm thử một potency assay. CAR T được đồng nuôi với dòng leukemia NALM6 mang CD19, rồi đo tỷ lệ tế bào đích bị tiêu diệt.

Nhiều CTM feature có tương quan với khả năng killing. Một đặc trưng kích thước có hệ số tương quan tuyệt đối trên 0,95 khi gộp dữ liệu từ cả hai nền tảng bioreactor. Các đặc trưng kết hợp size và deformability khác cũng cho tương quan mạnh, dù một số phụ thuộc vào nền tảng sản xuất.

Nhóm tiếp tục gom 88 feature thành một biophysical index bằng principal component analysis. Chỉ số tổng hợp này có tương quan −0,82 với potency assay trong tập dữ liệu mà họ phân tích và 0,68 với profile phenotype từ flow cytometry.

Đây là dữ kiện làm CTM khác một sorter chỉ tách tế bào lớn khỏi tế bào nhỏ. Mục tiêu không phải lấy ra một population theo ngưỡng đường kính, mà dùng cách cả quần thể phản ứng cơ học để suy ra trạng thái chức năng.

Vì sao điều này đáng chú ý với sản xuất CAR T?

CAR T tự thân được sản xuất riêng cho từng bệnh nhân. T cell phải được thu nhận, kích hoạt, biến đổi gene, mở rộng số lượng, kiểm tra chất lượng, đông lạnh, vận chuyển và cuối cùng truyền lại cho người bệnh. Mỗi bước có thể tạo thêm biến thiên.

Vấn đề là những phép đo chất lượng sâu thường không phù hợp để chạy liên tục trong suốt quá trình. Flow cytometry cần antibody và nhiều bước chuẩn bị mẫu. Potency assay trực tiếp, chẳng hạn cho CAR T giết tế bào đích, có thể mất hơn 10 giờ chưa tính chuẩn bị. Lấy quá nhiều mẫu cũng không lý tưởng khi chính sản phẩm tế bào là tài nguyên hữu hạn.

CTM nhắm vào khoảng trống này. Với 20 µL mẫu và thời gian dưới 10 phút, về nguyên tắc một nhà máy tế bào có thể lấy những aliquot nhỏ trong quá trình culture để theo dõi quần thể đang thay đổi thế nào, thay vì chờ tới cuối lô mới phát hiện bất thường.

Nếu một biophysical signature bắt đầu lệch khỏi trajectory thường thấy ở ngày thứ năm hoặc thứ bảy, quy trình tương lai có thể điều chỉnh môi trường nuôi, thời điểm thu hoạch hoặc các tham số khác sớm hơn. Đây là ý tưởng adaptive manufacturing: không coi bioreactor như một chiếc hộp đen chạy đủ số ngày rồi mới kiểm tra thành phẩm.

Nhưng “biophysical fitness” chưa phải một thước đo sức khỏe phổ quát

Đây là chỗ cần thận trọng nhất khi diễn giải nghiên cứu. CTM đo size và deformability rồi tìm mối tương quan với phenotype và function. Nó không trực tiếp đo ATP, trạng thái chuyển hóa, mức DNA damage hay khả năng sống lâu dài của từng tế bào.

Mối tương quan cũng không có nghĩa một CAR T mềm hơn hoặc cứng hơn mặc định là “tốt hơn”. Tính cơ học có thể thay đổi theo activation, trạng thái biệt hóa, cytokine, stress, cryopreservation và cả nền tảng manufacturing. Một feature có ý nghĩa ở G-Rex chưa chắc giữ cùng quan hệ trong một quy trình khác.

Quy mô dữ liệu hiện vẫn nhỏ so với điều cần có cho một phép thử release lâm sàng. Phần so sánh bioreactor cốt lõi dùng ba donor với các replicate kỹ thuật; nhóm sau đó bổ sung bốn mẫu từ bệnh nhân ung thư và bốn healthy donor trong một phân tích khác. Paper chưa chứng minh CTM dự báo được response, relapse hay survival của bệnh nhân sau CAR T.

Chính các tác giả mô tả deformability như một marker tương quan và có tiềm năng trở thành surrogate cho critical quality attributes. Đó là cách diễn đạt phù hợp hơn việc gọi nó là “máy đo sức khỏe tế bào”.

Từ sorter sang “stress test” cho tế bào

Điểm thú vị nhất của CTM có thể nằm ở cách nó tái sử dụng một nhược điểm cũ của microfluidics. Trong sorter truyền thống, tế bào biến dạng làm đường đi khó dự đoán. Trong CTM, chính sự lệch đó là dữ liệu.

Về ý tưởng, nó giống một stress test hơn một chiếc rây. Hai tế bào có thể có kích thước gần nhau khi đứng yên, nhưng khi bị ép qua cùng hình học ở cùng lưu lượng, chúng đáp ứng khác nhau. Sự khác nhau này chứa thông tin mà phép đo hình dạng tĩnh bỏ qua.

Nếu được xác nhận trên nhiều sản phẩm CAR T, nhiều quy trình manufacturing và dữ liệu lâm sàng lớn hơn, cách tiếp cận này có thể giúp cell therapy tiến từ kiểm tra “tế bào có những marker nào” sang câu hỏi chức năng hơn: “khi gặp một tác động vật lý được chuẩn hóa, chúng cư xử như thế nào?”.

Bước tiếp theo vì vậy không chỉ là làm chip nhanh hơn. CTM cần chứng minh những dấu vân tay cơ học của nó ổn định giữa các lab, giữa các thiết bị, qua nhiều loại CAR construct và quan trọng nhất là có liên hệ đáng tin cậy với hiệu quả thật ở bệnh nhân. Nếu vượt qua được bước đó, một đường microfluidic chỉ vài centimet có thể trở thành cách kiểm tra chất lượng cell therapy mà không cần gắn thêm nhãn lên chính tế bào đang được chuẩn bị để truyền cho người bệnh.

Nguồn chính: Nature Communications — Cell trajectory modulation: rapid microfluidic biophysical profiling of CAR T cell functional phenotypes; SMART CAMP.