Vi khuẩn đọc mRNA để sản xuất protein nhưng “bản hướng dẫn” chỉ tồn tại vài phút: Nhóm nghiên cứu nối nó thành vòng và tăng sản lượng gần 6 lần

Trong một tế bào vi khuẩn, mRNA là bản sao làm việc của gene: ribosome đọc nó để lắp amino acid thành protein. Vấn đề là bản sao này thường chỉ tồn tại trong vài phút. Với vi khuẩn sống ngoài tự nhiên, vòng đời ngắn giúp chúng đổi chương trình gene nhanh khi môi trường thay đổi. Nhưng trong một “nhà máy tế bào” được nuôi để liên tục sản xuất enzyme hay hóa chất, việc bản hướng dẫn bị phá hủy quá sớm có thể trở thành nút thắt năng suất.

Một nhóm tại Seoul National University đã thử giải quyết vấn đề đó bằng cách không làm mRNA nhiều hơn, mà đổi hình dạng của nó. Hệ thống có tên CRESEnT — Circular RNA Expression for Stable and Enhanced Translation — khiến một mRNA tuyến tính tự khép hai đầu thành vòng ngay bên trong vi khuẩn. Trong cấu hình tối ưu, lượng protein huỳnh quang mCherry tăng 5,95 lần so với đối chứng không tạo vòng, trong khi lượng mRNA trong tế bào tăng 3,95 lần. Kết quả được công bố trên Nucleic Acids Research.

Hai đầu tự do khiến mRNA trở thành mục tiêu dễ xử lý của hệ thống phân hủy RNA

mRNA không được tạo ra để tồn tại vĩnh viễn. Sau khi hoàn thành vai trò truyền thông tin từ DNA tới ribosome, nó bị các ribonuclease phân giải để tế bào có thể điều chỉnh lượng protein theo nhu cầu mới.

Ở vi khuẩn, quá trình này đặc biệt nhanh. Không giống mRNA điển hình ở tế bào nhân thực, mRNA của vi khuẩn không có cấu trúc mũ 5′ và đuôi poly(A) đóng vai trò tương tự hệ bảo vệ và điều hòa độ bền như ở nhiều transcript nhân thực. Các đầu RNA tự do cùng những vùng RNA không được ribosome che phủ có thể trở thành điểm để hệ thống phân hủy tiếp cận.

Nhóm của giáo sư Sang Woo Seo đặt câu hỏi theo hướng khá trực tiếp: nếu hai đầu là một phần của vấn đề, điều gì xảy ra khi không còn đầu nào nữa?

CRESEnT để mRNA tự nối thành vòng ngay trong tế bào

CRESEnT dựa trên một kiến trúc gọi là permuted intron–exon. Nhóm nghiên cứu lấy intron nhóm I Td của bacteriophage T4 làm khung, tách và sắp xếp lại các phần intron sao cho sau khi transcript được tạo ra, phản ứng tự splicing sẽ nối hai đầu của vùng RNA mang gene mục tiêu lại với nhau.

Kết quả là gene mã hóa protein nằm trên một phân tử RNA vòng đóng kín bằng liên kết cộng hóa trị. Quá trình này diễn ra in vivo, tức ngay trong tế bào vi khuẩn; không cần thu RNA ra ngoài, dùng enzyme ligase để nối rồi đưa trở lại tế bào.

Vòng hóa không tự động có nghĩa là biểu hiện protein sẽ cao. Các mảnh intron vẫn phải tìm đúng nhau và gấp cuộn đúng hình để phản ứng splicing diễn ra hiệu quả, trong khi ribosome vẫn phải tiếp cận vùng khởi đầu dịch mã. Vì vậy phần lớn công việc của nhóm không nằm ở ý tưởng “nối hai đầu”, mà ở việc tìm hình học RNA phù hợp để hệ thống đó thực sự hoạt động ổn định.

Độ dài UTR phải vừa đủ: dài quá dễ bị cắt, ngắn quá intron khó gấp

Nhóm xác định hai tham số thiết kế quan trọng. Đầu tiên là độ dài của các vùng không dịch mã, hay UTR, nằm giữa intron và vùng mã hóa protein. Nếu UTR quá dài, một đoạn RNA không được ribosome bảo vệ sẽ lộ ra nhiều hơn và dễ bị nuclease tấn công. Nếu quá ngắn, không gian quanh intron lại trở nên chật, cản trở cấu trúc RNA cần cho quá trình splicing.

Trong hệ thử nghiệm mCherry, cấu hình cho kết quả tốt nhất dùng 5′ UTR dài 35 nucleotide và 3′ UTR dài 24 nucleotide. Protein tạo ra thay đổi cùng chiều với hiệu suất vòng hóa, cho thấy lợi ích không chỉ đến từ việc thay đổi chuỗi UTR mà gắn với việc tạo được nhiều circular mRNA hơn.

Tham số thứ hai là những đoạn bổ sung ngắn nằm trên hai mảnh intron. Chúng hoạt động giống hai nửa khóa kéo: bắt cặp với nhau để đưa các phần RNA cần nối lại gần nhau. Khi tăng chiều dài của các “hybridization arm”, hiệu suất vòng hóa và lượng protein đều tăng tới một ngưỡng. Nhưng khi các đoạn bắt cặp dài quá 35 base pair, hiệu quả lại giảm, nhiều khả năng vì vùng RNA sợi đôi dài hơn trở thành mục tiêu của RNase III.

Nhóm chọn các hybridization arm 30 bp cho phiên bản tối ưu. Đây là cấu hình tạo ra mức tăng mCherry 5,95 lần so với control tuyến tính.

Gần 6 lần protein không có nghĩa dịch mã nhanh hơn 6 lần

Đây là điểm quan trọng nhất khi đọc con số headline. Nhóm đo lượng RNA bằng droplet digital PCR và thấy CRESEnT tối ưu làm lượng transcript trong tế bào tăng 3,95 lần. Khi họ chặn quá trình phiên mã bằng rifampicin rồi theo dõi RNA trong 10 phút, lượng RNA tuyến tính giảm dần, còn transcript CRESEnT gần như không thay đổi trong cửa sổ đo đó. Dữ liệu này cho thấy phần lớn lợi ích đến từ việc RNA tồn tại lâu hơn.

Tuy nhiên, độ bền không phải toàn bộ câu chuyện. Khi chuẩn hóa tín hiệu protein theo lượng transcript, CRESEnT vẫn tạo ra nhiều protein hơn trên mỗi phân tử RNA: giá trị chuẩn hóa tăng từ 15,9 lên 24,1, tương đương 1,51 lần. Nói cách khác, mức tăng gần sáu lần ở mCherry là kết quả kết hợp giữa nhiều mRNA còn tồn tại hơn và mỗi transcript trung bình tạo ra nhiều protein hơn, chứ không phải ribosome bỗng dịch mã nhanh gấp sáu lần.

Không chỉ một reporter và không chỉ E. coli

Một công nghệ biểu hiện gene chỉ thực sự hữu ích nếu nó không phụ thuộc vào đúng một promoter, một ribosome-binding site hay một gene báo cáo. Nhóm đã thay đổi promoter và RBS, thử các fluorescent reporter khác nhau, đồng thời gắn mCherry với các protein nội sinh có kích thước khác nhau. Với cargo dài từ 1.371 đến 3.543 bp, CRESEnT vẫn làm tăng biểu hiện so với control tuyến tính; paper báo cáo mức tăng 1,60–7,29 lần tùy construct. Cargo lớn nhất cho mức tăng thấp nhất trong nhóm thử nghiệm, phù hợp với ý tưởng rằng RNA càng dài thì việc kéo hai đầu lại gần để splicing càng khó.

Hệ thống cũng được chuyển khỏi E. coli K-12 MG1655. Các tác giả cho thấy nó hoạt động trong Bacillus subtilis và Corynebacterium glutamicum, hai vi khuẩn có vai trò quan trọng trong công nghệ sinh học công nghiệp. Điều này chưa chứng minh CRESEnT dùng được với mọi vi sinh vật, nhưng cho thấy cơ chế không bị khóa vào một chủng E. coli duy nhất.

Từ nhiều protein hơn tới nhiều sản phẩm lên men hơn

Nhóm sau đó hỏi câu hỏi thực dụng hơn: tăng enzyme có thực sự làm “nhà máy tế bào” tạo nhiều sản phẩm hơn không? Họ đưa CRESEnT vào bốn đường sinh tổng hợp.

Với enzyme RppA, sản lượng flaviolin tăng 2,74 lần so với control tuyến tính. Itaconate tăng khoảng 1,52 lần. Khi điều khiển một enzyme giới hạn dòng trong các đường nhiều bước, lycopene tăng 1,60 lần và violacein tăng 1,62 lần.

Những con số này nhỏ hơn mức tăng gần sáu lần của reporter, và đó là điều hợp lý. Trong một đường chuyển hóa, nhiều protein hơn không đảm bảo sản phẩm cuối tăng theo cùng tỷ lệ: nguyên liệu đầu vào, enzyme khác, cân bằng cofactor, độc tính của sản phẩm và dòng chuyển hóa cạnh tranh đều có thể trở thành giới hạn mới.

Đây là công cụ cho synthetic biology vi khuẩn, chưa phải “mRNA vòng” dùng ngay cho người

Circular RNA đang được nghiên cứu trong nhiều bối cảnh, trong đó có vaccine và liệu pháp RNA ở tế bào động vật. Nhưng CRESEnT trong nghiên cứu này được thiết kế và kiểm chứng như một hệ biểu hiện gene trong vi khuẩn. Dữ liệu không cho phép suy ra rằng cùng cassette sẽ giúp mRNA trị liệu trong cơ thể người tồn tại lâu hơn hoặc tạo protein nhiều hơn ở mức tương tự.

Ngay trong vi khuẩn, vẫn còn những câu hỏi trước khi có thể xem đây là một module sản xuất phổ quát. Hiệu suất phụ thuộc vào chiều dài và kiến trúc cargo; vùng RNA sợi đôi quá dài có thể bị RNase III xử lý; và mức tăng biểu hiện protein không chuyển trực tiếp thành cùng mức tăng sản phẩm chuyển hóa. Những hệ thống quy mô công nghiệp cũng cần đánh giá thêm về gánh nặng chuyển hóa, độ ổn định plasmid, tính lặp lại qua nhiều thế hệ và năng suất trong điều kiện lên men lớn.

Điều CRESEnT bổ sung cho synthetic biology là một nút điều khiển khác. Thay vì chỉ tăng promoter để tạo thêm RNA hoặc chỉnh RBS để ribosome bám tốt hơn, kỹ sư có thể can thiệp vào topology của chính mRNA: giữ cùng “bản hướng dẫn” trong tế bào lâu hơn để ribosome có thêm cơ hội sử dụng nó. Bước tiếp theo sẽ là xác định khi nào lợi ích từ vòng hóa đủ lớn để bù cho độ phức tạp thiết kế, và liệu nguyên tắc này có giữ được hiệu quả trong những cell factory sản xuất ở quy mô công nghiệp hay không.

Nghiên cứu: Seongjun Park, Giho Kim và cộng sự, “Programmable in vivo mRNA circularization for enhanced gene expression in bacteria”, Nucleic Acids Research, 2026. DOI: 10.1093/nar/gkag854. Thông tin và hình minh họa chính thức cũng được Seoul National University công bố trong phần Research News.