Một phân tử có thể có hai “bàn tay”, nhưng thuốc chỉ cần một: Nhóm Frances Arnold tiến hóa enzyme để xây đúng cấu hình cho kháng sinh lao

Hai phân tử có thể có cùng nguyên tử, cùng liên kết hóa học và vẫn hành xử rất khác trong cơ thể chỉ vì chúng được sắp xếp theo hai hướng đối xứng như tay trái và tay phải. Với một nhóm oxazolidinone đang được phát triển để chống lao kháng thuốc, cấu hình tại carbon số 5 đặc biệt quan trọng: dạng (S) là cấu hình cần cho hoạt tính kháng khuẩn, còn ảnh gương của nó không mang cùng tác dụng.

Nhóm của Frances H. Arnold tại Caltech, cùng các cộng sự ở University of Pittsburgh, vừa công bố trên Nature một cách khác để tạo đúng “bàn tay” đó. Thay vì bắt đầu từ nguyên liệu đã có sẵn tính chirality rồi giữ cấu hình qua nhiều bước tổng hợp, họ dùng một enzyme đã được tiến hóa định hướng để xây stereocentre mong muốn trực tiếp từ alkene đơn giản. Phản ứng là một chuỗi aziridination rồi mở rộng vòng do haemprotein xúc tác, tạo ra các oxazolidinone chiral liên quan tới thuốc chống lao đang được nghiên cứu.

Điểm cần nhấn mạnh là đây chưa phải một dây chuyền sản xuất thuốc mới. Các tác giả gọi công trình là bước chứng minh rằng enzyme có thể thực hiện hóa học này với độ chọn lọc phù hợp; Caltech cũng nói rõ còn một quãng đường dài trước khi biết quy trình có thể sản xuất ở quy mô lớn hay không.

“Hai phân tử giống hệt” thực ra khác nhau ở hình học 3D

Ví dụ bàn tay thường được dùng để giải thích enantiomer. Tay trái và tay phải có cùng số ngón, các ngón nối vào cùng một bàn tay, nhưng không thể chồng khít hoàn toàn lên nhau. Một số phân tử cũng vậy: công thức và cách các nguyên tử nối với nhau giống nhau, nhưng cách chúng hướng trong không gian quanh một stereogenic centre là ảnh gương không chồng khít.

Sự khác biệt nghe có vẻ nhỏ này lại quan trọng trong sinh học vì protein, enzyme và receptor của cơ thể cũng có cấu trúc ba chiều. Một enantiomer có thể vừa đúng vào vị trí liên kết, trong khi enantiomer còn lại tương tác yếu hơn, theo cách khác hoặc gần như không có tác dụng mong muốn.

Với 5-aminomethyl oxazolidinone dùng làm khung cho một số kháng sinh, cấu hình C5 dạng (S) là cấu hình quan trọng đối với hoạt tính kháng khuẩn. Vì thế hóa học dược phẩm không chỉ cần tạo đúng tập hợp nguyên tử; nó còn phải kiểm soát chúng quay về phía nào trong không gian.

Vấn đề không đơn giản là “một nửa mẻ thuốc bị bỏ đi”

Một phản ứng không kiểm soát chirality có thể tạo hỗn hợp hai enantiomer. Nếu tỷ lệ gần 50:50 mà chỉ một dạng hữu ích, nhà sản xuất phải tách chúng hoặc chấp nhận mất một phần vật liệu. Nhưng đó không phải cách duy nhất ngành dược hiện nay xử lý bài toán này.

Paper trên Nature lưu ý rằng các tuyến tổng hợp oxazolidinone chiral thông thường thường dựa vào chiến lược chiral pool: bắt đầu từ amino alcohol hoặc nguyên liệu đã tinh khiết về enantiomer, rồi dùng chirality có sẵn đó để dẫn đường cho các bước tiếp theo. Cách làm này tránh việc tạo một hỗn hợp racemic rồi vứt đi một nửa, nhưng đổi lại quá trình tổng hợp phụ thuộc vào các building block chiral đã được chuẩn bị trước.

Nhóm Arnold muốn đi theo hướng khác: lấy một alkene tương đối đơn giản và để enzyme tự tạo stereocentre mong muốn trong chính bước hình thành khung oxazolidinone.

Enzyme không sinh ra để làm phản ứng này — nên nhóm nghiên cứu “tiến hóa” nó

Enzyme tự nhiên rất giỏi chọn một cấu hình phân tử vì active site của chúng cũng là những cấu trúc ba chiều bất đối xứng. Vấn đề là tự nhiên không nhất thiết đã tiến hóa enzyme cho đúng phản ứng mà nhà hóa học muốn dùng trong nhà máy.

Nhóm nghiên cứu bắt đầu từ thư viện hơn 5.000 enzyme mà phòng thí nghiệm đang lưu giữ, theo Caltech. Sau khi sàng lọc vài trăm ứng viên, họ tìm được một haemprotein có hoạt tính ban đầu đủ để làm điểm xuất phát. Nó chưa phải chất xúc tác tốt, nhưng đã thực hiện được phản ứng cần thiết.

Từ đây nhóm dùng directed evolution, phương pháp gắn liền với giải Nobel Hóa học 2018 của Frances Arnold. Thay vì cố thiết kế toàn bộ protein bằng suy luận từ đầu, các nhà nghiên cứu tạo biến thể bằng cách thay đổi gene mã hóa enzyme, kiểm tra những protein mới, giữ lại biến thể hoạt động tốt hơn rồi lặp lại chu kỳ. Qua nhiều vòng, những mutation có ích được tích lũy.

Trong nghiên cứu mới, mục tiêu không chỉ là tăng lượng sản phẩm. Enzyme còn phải kiểm soát stereochemistry, tức ưu tiên tạo cấu hình (S) thay vì ảnh gương của nó. Phân tích tính toán của nhóm University of Pittsburgh cho thấy các mutation được đưa vào qua quá trình tiến hóa đã thay đổi môi trường của active site theo cách có thể giải thích độ chọn lọc enantiomer của sản phẩm.

Một chuỗi phản ứng mà haemprotein trước đây chưa làm tốt với alkene “thường”

Về mặt hóa học, nhóm phát triển một chuỗi aziridination/ring expansion. Bước đầu tạo vòng aziridine ba cạnh chứa nitrogen từ alkene thông qua hóa học nitrene transfer do haemprotein xúc tác. Sau đó hệ thống chuyển tiếp sang cấu trúc vòng oxazolidinone năm cạnh mong muốn.

Hóa học nitrene transfer bằng haemprotein đã được các nhóm nghiên cứu phát triển trong nhiều năm, nhưng paper mới mở rộng nó sang việc functionalize unactivated alkenes. Đây là các nối đôi không được “hỗ trợ” bởi những nhóm điện tử như trong styrene, nên thường khó phản ứng chọn lọc hơn. Nature mô tả các hệ trước đó chủ yếu bị giới hạn ở những substrate liên hợp như styrene.

Kết quả là nhóm có thể đi từ những alkene đơn giản tới một loạt oxazolidinone chiral, trong đó có các cấu trúc liên quan tới kháng sinh chống Mycobacterium tuberculosis ở cả giai đoạn lâm sàng và giai đoạn discovery.

Ý nghĩa đối với sản xuất thuốc nằm ở việc xây chirality ngay từ đầu

Nếu một enzyme có thể vừa tạo liên kết mới vừa đặt stereocentre đúng hướng, nhà hóa học có thể loại bớt những bước dành riêng cho việc tạo, bảo vệ hoặc tách chirality. Về nguyên tắc, điều đó có thể giảm số bước, giảm vật liệu phụ và giảm lượng sản phẩm không mong muốn.

Đây cũng là lý do biocatalysis đã được ngành dược quan tâm từ lâu. Enzyme hoạt động trong những môi trường tương đối nhẹ và active site của chúng có thể phân biệt rất tinh tế giữa hai hình học gần như giống nhau. Directed evolution bổ sung phần còn thiếu: nếu enzyme tự nhiên chưa làm đúng phản ứng, người ta có thể thay đổi chuỗi protein rồi chọn lọc cho đến khi có chất xúc tác phù hợp hơn với bài toán công nghiệp.

Tuy nhiên, “có thể tổng hợp chọn lọc trong phòng thí nghiệm” và “có quy trình sản xuất thuốc kinh tế” là hai mốc khác nhau. Một quy trình công nghiệp còn phải chứng minh enzyme ổn định ở nồng độ substrate cao, có tổng số vòng xúc tác đủ lớn, dễ sản xuất, dễ tách sản phẩm, tương thích với các bước trước và sau, đồng thời có chi phí thấp hơn tuyến hóa học hiện hành.

Đây là proof of concept, không phải công thức làm thuốc rẻ ngay lập tức

Caltech cho rằng con đường này có thể giúp giảm chi phí và chất thải trong tương lai, đặc biệt với thuốc chống lao kháng thuốc — lĩnh vực mà giá thành có ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng tiếp cận ở những nơi gánh nặng bệnh cao. Nhưng chính tác giả Zi-Qi Li cũng mô tả nghiên cứu mới là việc giải quyết “bước đầu tiên”: chứng minh enzyme có thể tạo những phân tử cần thiết.

Chưa có dữ liệu trong thông báo của Caltech cho thấy quy trình đã chạy ở quy mô nhà máy hoặc cạnh tranh trực tiếp về giá với tuyến sản xuất đang dùng. Paper cũng tập trung vào phản ứng và khả năng điều khiển stereochemistry, không phải một phân tích techno-economic của toàn bộ dây chuyền dược phẩm.

Bước tiếp theo vì vậy không chỉ là tiến hóa enzyme để chọn (S) tốt hơn. Nhóm nghiên cứu hoặc các nhà sản xuất còn phải chứng minh catalyst chịu được điều kiện process, mở rộng quy mô mà không mất selectivity, và thực sự rút ngắn hoặc hạ chi phí so với chiral-pool synthesis hiện có. Nếu những bước đó thành công, ý tưởng đáng chú ý nhất của nghiên cứu sẽ không phải là “enzyme làm thuốc”, mà là enzyme có thể được huấn luyện bằng tiến hóa để xây đúng hình học phân tử ngay khi liên kết mới được tạo ra.

Nguồn: Nature — Chiral oxazolidinones via biocatalytic aziridination of unactivated alkenes; Caltech — Utilizing Enzymes to Help Treat Tuberculosis.